Zasady wykonywania chromatografii TLC

Chromatografia

Chromatografia jest metodą rozdziału wykorzystującą różnice w oddziaływaniu poszczególnych związków z dwiema fazami: fazę stacjonarną (ciecz lub ciało stałe) i fazę ruchomą (ciecz lub gaz). Chromatografia znajduje szerokie zastosowanie jako metoda wyodrębniania i oczyszczania związków (m.in.chromatografia kolumnowa) jak również analiz mieszanin (m.in. chromatografia cienkowarstwowa TLC)

	CHROMATOGRAFIA
ROZDZIELCZA rozdział polega na podziale składników mieszaniny pomiędzy fazy stacjonarną i ruchomą		ADSORPCYJNA rozdział polega na selektywnej adsorpcji składników mieszaniny na powierzchni ciała stałego
(układ ciecz-ciecz)	(układ ciecz-gaz)	(układ ciało stałe-ciecz)
chromatografia bibułowa	chromatografia gazowa	chromatografia kolumnowa	chromatografia cienkowarstwowa TLC

Chromatografia adsorpcyjna

Adsorpcję (nagromadzenie substancji na zewnętrznej powierzchni ciał stałych) wykorzystuje się do rozdzielenia mieszanin na podstawie różnic w powinowactwie różnych ciał stałych na powierzchni adsorbenta.

Środki adsorbujące można podzielić na:

• niepolarne (węgiel aktywny, niektóre żywice organiczne)

• polarne (tlenek glinu, żel krzemionkowy, węglowodany tj. skrobia, cukier, celuloza)

W przypadku polarnego adsorbenta kolejność z jaką składniki mieszaniny pojawiają się na płytce TLC zależy od ich względnych polarności. Tak więc w przypadku dwóch składników różniących się polarnością składnik bardziej polarny silniej adsorbuje się na powierzchni adsorbenta (na płytce TLC znajduje się bliżej linii startu), natomiast składnik mniej polarny eluowany jest niepolarnym rozpuszczalnikiem (na płytce TLC znajduje się wyżej od składnika bardziej polarnego).

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

W metodzie tej stosuje się warstwę fazy stacjonarnej (najczęściej żel krzemionkowy) naniesionej na podłoże (płytki szklane, folia aluminiowa, folia z PEG), przylegającej do płytki dzięki dodatkowi środka wiążącego np. siarczanu wapnia, gipsu). Fazą ruchomą jest ciecz (rozpuszczalniki organiczne lub ich mieszaniny).

Chromatografia cienkowarstwowa służy do szybkiej analizy jakościowej. Stosuje się ją głównie do określenia liczby składników w próbce, do wykrywania określonego związku w mieszaninie oraz jako wstępną próbę przy poszukiwaniu warunków do chromatografii kolumnowej.

Wykonanie analizy TLC obejmuje następujące czynności:

• przygotowanie płytki

• naniesienie badanego roztworu (ewentualnie wzorców, substratów)

• rozwinięcie chromatogramu

• wywołanie chromatogramu

• analizę wyników

Przygotowanie płytki

Przygotowanie płytki pokrytej żelem krzemionkowym polega na jej przycięciu nożyczkami do odpowiedniego wymiaru, zaznaczeniu ołówkiem linii startowej w odległości ok. 1cm od dolnego brzegu i torów, na które będą nanoszone badane roztwory.

Nanoszenie próbki na płytkę.

Nanoszoną próbkę rozpuszczamy w dowolnym, łatwo lotnym rozpuszczalniku. Roztwór o stężeniu ok. 5-10% sporządzamy w probówce Eppendorfa. Próbkę nanosimy na płytkę za pomocą cienkiej kapilary. Kapilarę zanurzamy w roztworze, a następnie dotykamy lekko jej końcem płytkę chromatograficzną na linii startowej. Należy starać się, aby powstająca plama miała średnicę nie większą niż 2-3mm.

Rozwijanie chromatogramu.

Chromatogram rozwijamy w komorze chromatograficznej. Wewnątrz komory stawiamy bibułę, która nasiąkając rozpuszczalnikiem utrzymuje nasycenie komory jego parami. Do komory nalewamy rozpuszczalnik lub mieszaninę rozpuszczalników do wysokości ok.0.5 cm, należy zwrócić przy tym uwagę, czy poziom rozpuszczalnika znajduje się poniżej linii startowej. Płytkę wstawiamy do komory pionowo - linią startową do dołu i zakrywamy pokrywkę. W wyniku działania sił kapilarnych eluent wznosi się po płytce - powstaje więc chromatogram "wstępujący". Gdy rozpuszczalnik osiągnie wysokość ok. 0.5 cm od górnej krawędzi płytki, wyjmujemy ją z komory, zaznaczamy czoło rozpuszczalnika i pozostawiamy do wyschnięcia lub suszymy suszarką.

Przykład prostej komory chromatograficznej:

Wartością charakterystyczną dla danego związku w danych warunkach chromatograficznych (faza stacjonarna, podłoże, rozpuszczalnik) jest współczynnik podziału Rf. Jest on zdefiniowany jako stosunek drogi, jaką na płytce przebył dany związek (droga a), do drogi, jaką w tym czasie przebyło czoło rozpuszczalnika (droga b).

a - odległość od linii startowej do środka plamy

b - odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika

f - czoło rozpuszczalnika

s - linia startowa

Wywoływanie chromatogramu

pozycje związków barwnych można ustalić bez trudu:

• pozycje związków bezbarwnych, fluoryzujących pod wpływem promieniowania ultrafioletowego można określić umieszczając płytkę w świetle lampy UV o długości fali 254 nm.

• umieszczenie płytki w pojemniku zawierającym kryształki jodu. Związki organiczne barwią się na brązowo. Plamy należy obrysować bezpośrednio po wyjęciu płytki, gdyż w skutek parowania jodu plamy zanikają.

• substancje organiczne można wykryć przez spryskanie stężonym kwasem siarkowym lub roztworem stężonego kwasu siarkowego w metanolu i następnie wygrzanie w temp 200^oC do czasu, gdy na płytce pojawią się ciemne plamy zwęglonych substancji organicznych.

• do wywołania związków bezbarwnych stosuje się często metody chemiczne polegające na spryskaniu płytki odczynnikiem, który daje barwną reakcję z wywoływaną substancją. Zwykle jest to odczynnik selektywny, reagujący z określoną grupą lub grupami funkcyjnymi i bardzo czuły, np. ninhydryna stosowana do wykrywania aminokwasów - daje intensywnie zabarwione na niebiesko produkty.